Basi strutturali della sintesi del peptidoglicano da parte di E. coli RodA
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Basi strutturali della sintesi del peptidoglicano da parte di E. coli RodA

Jul 13, 2023

Nature Communications volume 14, numero articolo: 5151 (2023) Citare questo articolo

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Il peptidoglicano (PG) è un componente strutturale essenziale della parete cellulare batterica che viene sintetizzato durante la divisione e l'allungamento cellulare. Il PG forma un polimero extracellulare cruciale per la vitalità cellulare, la cui sintesi è l'obiettivo di molti antibiotici. L'assemblaggio della PG richiede una glicosiltransferasi (GT) per generare un polimero glicanico utilizzando un substrato del lipide II, che viene poi reticolato alla PG esistente tramite una reazione della transpeptidasi (TP). Un enzima GT di forma, allungamento, divisione e sporulazione (SEDS) e una proteina legante la penicillina (PBP) di classe B costituiscono il nucleo del complesso multiproteico necessario per l'assemblaggio delle PG. Qui abbiamo utilizzato la microscopia crioelettronica a singola particella per determinare la struttura di un complesso E. coli RodA-PBP2 specifico per l'allungamento cellulare. Combiniamo queste informazioni con analisi biochimiche, genetiche, spettroscopiche e computazionali per identificare i siti di legame del lipide II e proporre un meccanismo per la polimerizzazione del lipide II. I nostri dati suggeriscono un'ipotesi per il movimento del filamento di glicano dal sito di polimerizzazione del lipide II di RodA verso il sito TP di PBP2, collegando funzionalmente queste due attività enzimatiche centrali richieste per la biosintesi del peptidoglicano della parete cellulare.

La forma cellulare nei batteri è determinata e mantenuta dal polimero extracellulare peptidoglicano (PG), un sacco a forma di rete che circonda la membrana citoplasmatica composta da catene di glicani polimerizzati reticolate da corti peptidi1. La sintesi di PG limita la velocità della crescita batterica e la sua interruzione provoca la lisi cellulare o la cessazione della crescita, come sfruttato da molti prodotti naturali e antibiotici semisintetici2,3,4,5. Questi includono i β-lattamici, gli antibiotici di maggior successo clinico fino ad oggi6,7. Le proteine ​​citoplasmatiche che sintetizzano il precursore della PG, il Lipide II – un disaccaride legato al pirofosfato (Und-PP) undecaprenil (C55) di N-acetilglucosamina (GlcNAc) e pentapeptide dell'acido N-acetilmuramico (MurNAc) – e le proteine ​​extracellulari responsabili della la successiva polimerizzazione del PG, sono state caratterizzate individualmente, biochimicamente e strutturalmente8,9.

Nel periplasma, la biosintesi della PG inizia con una glicosiltransferasi (GT) specifica del lipide II che forma un polimero a filamento di glicani collegando i disaccaridi di due molecole di lipide II, una chiamata donatore e l'altra accettore, e quindi rilasciando Und-PP da il sito donatore (Fig. 1a). Dopo che le due molecole iniziali di Lipid II sono state collegate insieme, il tetra-disaccaride risultante attaccato a Und-PP, chiamato Lipid IV, diventa il donatore di un altro accettore di Lipid II, collegando a sua volta il suo tetra-saccaride al disaccaride di Lipid II. per produrre il lipide VI. Questo ciclo si ripete in modo processivo creando catene polisaccaridiche progressivamente più lunghe attaccate a Und-PP (il numero romano indica il numero di gruppi monosaccaridici nella catena polisaccaridica). Una volta che il polimero glicanico in crescita raggiunge una lunghezza sufficiente, viene attaccato al sacco PG esistente tramite legami incrociati peptidici tra il pentapeptide del filamento glicanico e uno stelo peptidico sul sacco PG esistente mediante una transpeptidasi (TP) per produrre PG reticolato (Fig. 1a). In E. coli, la GT RodA della famiglia Shape, Elongation, Division e Sporulation (SEDS) e PBP2, la proteina monofunzionale legante la penicillina di classe B TP, mediano questi rispettivi compiti enzimatici10. RodA è una proteina integrale di membrana costituita da dieci eliche transmembrana (TM)11, mentre PBP2 ha una singola elica TM e un dominio extracellulare con una classica piega PBP di classe B contenente il sito attivo TP12,13. Insieme costituiscono il nucleo dell'elongasome14, il complesso responsabile della determinazione della forma dei bastoncini batterici. Nonostante i recenti progressi nella nostra comprensione di questa macchina molecolare15,16, non ultimo come derivata dalla struttura cristallina di un complesso Thermus thermophilus RodA-PBP217, le questioni meccanicistiche fondamentali rimangono irrisolte. Questi includono la caratterizzazione dei determinanti molecolari e degli stati conformazionali richiesti per i) il legame del lipide II, ii) la polimerizzazione GT dei filamenti di glicani e iii) la successiva traslocazione del polimero dei glicani nel sito attivo TP.

95% humidity. Images were recorded using a Titan Krios electron microscope (FEI), at the Columbia University Cryo-Electron Microscopy Center, equipped with an energy filter and a K3 direct electron detection filter camera (Gatan K3-BioQuantum) using a 0.83 Å pixel size. An energy filter slit width of 20 eV was used during the collection and was aligned automatically every hour using Leginon43. Data collection was performed using a dose of ~58.5 e-/Å2 across 50 frames (50 ms per frame) at a dose rate of approximate 16.1 e–/pix/s, using a set defocus range of -1 μm to -2.5 μm. A 100 µm objective aperture was used. 11,120 micrographs were recorded over a two-day collection./p> 1.1 nm), and van der Waals (VdW) interactions also used a cut-off of 1.1 nm (both with the Verlet cut-off scheme). The P-LINCS algorithm expanded up to 4th order was used for the treatment of holonomic constraints77. Each system was equilibrated for 10 ns, after which 10 μs production runs were prepared from the coordinates and velocities of the final frames of the equilibration trajectories. For RodA and RodA-PBP2, 50 repeats of the production simulations were conducted./p>

3.0.CO;2-H" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-987X%28199709%2918%3A12%3C1463%3A%3AAID-JCC4%3E3.0.CO%3B2-H" aria-label="Article reference 77" data-doi="10.1002/(SICI)1096-987X(199709)18:123.0.CO;2-H"Article CAS Google Scholar /p>